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電化學發(fā)光免疫測定(electrochemiluminescence immunoassay，ECLl)是電化學發(fā)光(ECL)和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物。ECLI中標記物的發(fā)光原理與一般的化學發(fā)光(CL)不同，是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化學發(fā)光2個過程。ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發(fā)光反應，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。在電化學發(fā)光免疫測定中應用的標記物為電化學發(fā)光反應的底物三聯(lián)吡啶釕，其衍生物N—羥基琥珀酰胺(NHS)酯可通過化學反應與抗體或不同化學結(jié)構(gòu)的抗原分子結(jié)合，制成標記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分2個步驟進行。現(xiàn)以雙抗體夾心法測定TSH抗原為例介紹ECLI反應原理。
第1步：耦聯(lián)有活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即[Ru(bpy)3]2+N—羥基琥珀酰胺酯(NHS)的TSH抗體和結(jié)合了生物素的TSH抗體與待測血清同時加入一個反應杯中孵育。
第2步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應杯中，再次孵育，使生物素與親和素的結(jié)合，將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心。
第3步，蠕動泵將形成的[Ru(bpy)3]2+抗體—抗原—抗體—磁珠復合體吸人流動測量室，此時，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的TSH抗體（與生物素結(jié)合的和與[Ru(bpy)3] 2+結(jié)合的抗體)也被吸出測量室。
緊接著，蠕動泵加入含三丙胺(TPA)的緩沖液，同時電極加電壓，啟動ECL反應過程。發(fā)光劑[Ru(bpy)3]2+和電子供體TPA在陽極表面，可同時各失去一個電子而發(fā)生氧化反應，使2價的[Ru(bpy)3] 2+被氧化成3價，后者是一種強氧化劑；另一方面，TPA被氧化成陽離子自由基TPA…，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去1個質(zhì)子(H+)，形成自由基TPA·，這是一種很強的還原劑，可將1個電子給3價的[Ru(bpy)3)3] 2+，使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3] 2+通過熒光衰減機制，發(fā)射出一個波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的[Ru(bpy)3] 2+。該過程在電極表面周而復始地進行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與[Ru(bpy)3] 2+的濃度呈線性關(guān)系，故可測出待測抗原的含量。
ECLI具有以下優(yōu)點：①標記物可再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長，強度更高，易于測定；②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；③線性范圍寬，可達>104單位；④反應時間短，20min以內(nèi)可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持1年以上。目前ECLI不僅可以應用于所有的免疫測定，而且還可用于DNA／RNA探針的檢測。
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